SFB 472 - Molekulare Bioenergetik

Teilprojekt P15 Prisner

Mehrdimensionale EPR-Spektroskopie an proteingebundenen redoxaktiven paramagnetischen Zentren

Die paramagnetischen Zentren können dabei EPR-spektroskopisch in drei Klassen unterteilt werden:

Organische Radikale,
Übergangsmetallionen &
Eisenkomplexe

Transiente organische Radikale

(wie beispielsweise Chinone, Chlorophylle, Tyrosine) sind meist kurzlebige Zwischenprodukte in ET-Reaktionen und liegen demnach unter Gleichgewichtsbedingungen in Proteinen oft in zu geringen Konzentrationen vor, um mittels EPR direkt detektiert zu werden. Durch zeitaufgelöste Puls-EPR-Messungen, schnelles Einfrieren nach Reaktionsbeginn (freeze-quench) oder durch Änderung der Redoxbedingungen können diese Radikale beobachtet werden. Zur Unterscheidung und genauen Charakterisierung dieser Radikale und ihrer Bindungseigenschaften sind Hochfeld-EPR- (B > 3T), ENDOR- (Electron Nuclear Double Resonance) und Puls-EPR-Methoden notwendig. In vielen Fällen besitzen diese Moleküle lange Relaxationszeiten, so dass 1- und 2-dimensionale Puls-EPR-Methoden, wie ESEEM (Electron Spin Echo Envelope Modulation), HYSCORE (HYperfine Sublevel CORrElation spectroscopy) und PELDOR (Pulsed ELectron DOuble Resonance) sehr erfolgreich eingesetzt werden können, um die Proteinumgebung zu untersuchen.

Proteingebundene Übergangsmetalle

(wie beispielsweise Mn, Cu, Mo), die entweder strukturelle Bedeutung haben oder häufig an ET- und katalytischen Redoxreaktionen beteiligt sind, können in ihren paramagnetischen Zuständen mittels EPR-Spektroskopie untersucht werden. Die erhaltenen Spektren sind meist sehr komplex und enthalten neben den Hyperfeinkopplungen zu den Liganden (und eventuell des Metalls selbst) Informationen über die Spin-Bahn-Kopplung, den Ladungstransfer-Charakter, die Ligandenfelder sowie die Kovalenz der Ligandenbindungen, die sich im anisotropen G-Tensor niederschlagen. Um diese unterschiedlichen Effekte zu trennen, sind Multifrequenz-EPR-Messungen besonders wichtig, da die verschiedenen Beiträge sich durch ihre Abhängigkeit vom externen Magnetfeld unterscheiden. Im Gegensatz zu organischen Radikalen können an diesen Übergangsmetallionen bereits bei Standardmagnetfeldern von 0,3 T (X-Band-EPR) orientierungsselektive Messungen an ungeordneten Proteinproben durchgeführt werden, falls die oft kürzeren Relaxationszeiten dies zulassen. Dadurch können strukturelle Informationen (Abstände und Winkel) getrennt bestimmt werden.

Eisenkomplexe

(wie beispielsweise Eisen-Schwefel-Verbindungen FeS und Häm-Gruppen) bilden EPR-spektroskopisch eine besondere Klasse paramagnetischer Zentren in Proteinen. Sie zeichnen sich durch sehr kurze Relaxationszeiten aus, so dass sie erst bei tiefen Temperaturen (<60 K) zu beobachten sind. Hyperfein-Wechselwirkungen zu den Atomkernen sind selten im cw-EPR-Spektrum aufgelöst, können aber durch Puls-EPR bei sehr tiefen Temperaturen (T<5 K) gemessen werden. Die schnelle Relaxation dieser Komplexe kann jedoch benutzt werden, um strukturelle Information über paramagnetische Zentren der beiden anderen erwähnten Gruppen zu erhalten (bis zu einem Abstand von 1-3 nm). Da diese Komplexe oft Teil von ET-Ketten in Membranproteinen sind, ist diese Situation häufig gegeben. In diesen Fällen wird das Relaxationsverhalten der langsamer relaxierenden paramagnetischen Zentren durch die benachbarten Eisenkomplexe beeinflusst. Puls-EPR-Messungen der Relaxationsraten bei unterschiedlichen Temperaturen können dann Abstand und relative Orientierung der beiden paramagnetischen Moleküle im Protein liefern.

Geräte

In unserer Arbeitsgruppe stehen Puls- und cw-EPR-Spektrometer bei 0,1 T (3 GHz, S-Band), 0,3 T (9 GHz, X-Band) und bei 6,4 T (180 GHz, G-Band) zur Verfügung. Das gepulste S-Band- und das weltweit höchstfrequente gepulste G-Band-Spektrometer wurden in der Arbeitsgruppe entwickelt. Cw- und Puls-ENDOR-Experimente können im X-Band durchgeführt werden, PELDOR-Methoden wurden ebenfalls in der Arbeitsgruppe im S-Band und im X-Band entwickelt und erprobt. Vor allem eine Kombination dieser spezialisierten EPR-Methoden mit Informationen aus Röntgenstrukturdaten oder anderen spektroskopischen Techniken erlauben eine detaillierte Beschreibung der paramagnetischen Zentren und ihrer Funktion. Ein Paradebeispiel für solch eine synergetische und weitreichende Zusammenarbeit sind die Photosysteme I und II sowie photosynthetische Reaktionszentren aus Bakterien.